Геномные последовательности большинства вирусов известны.Зонды нуклеиновой кислоты, которые представляют собой короткие сегменты ДНК, предназначенные для гибридизации с комплементарными сегментами вирусной ДНК или РНК.Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является более эффективным методом обнаружения вирусов.Недавно были разработаны высокопроизводительные методы диагностики.
А. Метод гибридизации нуклеиновых кислот
Гибридизация нуклеиновых кислот, в основном включая саузерн-блоттинг (юзерн-блоттинг) и нозерн-блоттинг (нозерн-блоттинг), представляет собой быстро развивающийся новый метод в области диагностики вирусов.Смысл анализа гибридизации заключается в использовании коротких сегментов ДНК (называемых «зондами»), предназначенных для гибридизации с комплементарными сегментами вирусной ДНК или РНК.Путем нагревания или щелочной обработки двухцепочечные ДНК или РНК-мишени разделяются на одноцепочечные, а затем иммобилизуются на твердом носителе.После этого добавляется зонд и гибридизуется с целевой ДНК или РНК.Поскольку зонд помечен изотопом или нерадиоактивным нуклидом, целевая ДНК или РНК может быть обнаружена с помощью авторадиографии или биотин-авидиновой системы.Поскольку большинство вирусных геномов были клонированы и секвенированы, их можно обнаружить, используя вирус-специфические последовательности в качестве зондов в образце.В настоящее время методы гибридизации включают в себя: дот-блоттинг, гибридизацию in situ в клетках, ДНК-блоттинг (ДНК) (юзерн-блоттинг) и РНК-блоттинг (РНК) (нозерн-блоттинг).
Технология Б.ПЦР
В последние годы на основе ПЦР был разработан ряд методов амплификации нуклеиновых кислот in vitro для тестирования нечувствительных или некультивируемых вирусов.ПЦР представляет собой метод, с помощью которого можно синтезировать специфическую последовательность ДНК с помощью полимеразной реакции in vitro.Процесс ПЦР включает в себя термический цикл из трех этапов: денатурация, отжиг и удлинение. При высокой температуре (93℃~95℃) двухцепочечная ДНК разделяется на две одиночные цепи ДНК;затем при низкой температуре (37 ℃ ~ 60 ℃) два синтезированных нуклеотидных праймера отжигаются с комплементарными сегментами ДНК;тогда как при подходящей температуре для фермента Taq (72 ℃) синтез новых цепей ДНК начинается с 3'-конца праймера с использованием комплементарной ДНК в качестве матриц и одиночных нуклеотидов в качестве материалов.Таким образом, после каждого цикла одна цепь ДНК может быть амплифицирована в две цепи.Повторяя этот процесс, каждая цепь ДНК, синтезированная в одном цикле, может быть использована в качестве матрицы в следующем цикле, а количество цепей ДНК удваивается в каждом цикле, что означает увеличение производства ПЦР с логарифмической скоростью 2n.После 25-30 циклов продукция ПЦР идентифицируется с помощью электрофореза, а специфические продукты ДНК можно наблюдать в УФ-свете (254 нм).Благодаря специфичности, чувствительности и удобству ПЦР была принята для клинической диагностики многих вирусных инфекций, таких как ВГС, ВИЧ, ЦМВ и ВПЧ.Поскольку ПЦР очень чувствительна, она может обнаруживать ДНК вируса на уровне fg, операцию следует проводить очень осторожно, чтобы избежать ложноположительных результатов.Кроме того, положительный результат теста на нуклеиновые кислоты не означает, что в образце присутствует живой инфекционный вирус.
С широким применением метода ПЦР разрабатываются новые методы и методы, основанные на методе ПЦР, для различных целей тестирования.Например, количественная ПЦР в реальном времени может определять вирусную нагрузку;ПЦР in situ используется для выявления вирусной инфекции в тканях или клетках;Вложенная ПЦР может повысить специфичность ПЦР.Среди них количественная ПЦР в реальном времени была разработана более быстрыми темпами.Многие новые методы, такие как зонд гидролиза TaqMan, зонд гибридизации и зонд молекулярного маяка, были объединены в метод количественной ПЦР в реальном времени, который широко используется в клинических исследованиях.Помимо точного определения вирусной нагрузки в жидкостях организма пациентов, этот метод также может быть использован для выявления устойчивых к лекарственным препаратам мутантов.Таким образом, количественная ПЦР в реальном времени в основном применяется для оценки лечебного эффекта и наблюдения за переносимостью лекарств.
C. Высокопроизводительное обнаружение вирусных нуклеиновых кислот
Чтобы удовлетворить потребности в быстрой диагностике новых возникающих инфекционных заболеваний, были созданы различные высокопроизводительные методы обнаружения, такие как ДНК-чипы (ДНК).Для ДНК-чипов синтезируются специфические зонды, которые прикрепляются к небольшим кремниевым чипам с очень высокой плотностью, чтобы сформировать микрочип ДНК-зондов (ДНК), который можно гибридизовать с образцом.Сигнал гибридизации может быть получен с помощью конфокального микроскопа или лазерного сканера, а затем обработан компьютером, и может быть получен огромный набор данных, касающихся различных генов.Существует два вида ДНК-чипов.«Синтетический чип» устроен следующим образом: специфические олигонуклеотиды синтезируются непосредственно на чипах.Другой - чип пула ДНК.Клонированные гены или продукты ПЦР упорядоченно печатаются на предметном стекле.Преимуществом технологии ДНК-чипов является одновременное обнаружение огромного количества последовательностей ДНК.Последняя версия чипа обнаружения патогенов может одновременно идентифицировать более 1700 человеческих вирусов.Технология ДНК-чипов решила проблемы традиционных методов гибридизации нуклеиновых кислот и имеет очень широкое применение в диагностике вирусов и эпидемиологических исследованиях.
Время публикации: 23 декабря 2020 г.